芽孢杆菌活菌孢子计数

适用范围

本方法适用于液体及固体芽孢杆菌样品。

检测原理

采用孢子浓度法——十倍系列稀释后进行涂布平板计数，测定每克（或每毫升）芽孢杆菌样品中的活菌孢子数。

仪器与设备

• 电子天平0.0001克
• 压力蒸汽灭菌锅（高压灭菌器）—
• 恒温培养箱—
• 超声波细胞破碎仪——JY92-IIN（宁波新芝生物科技）650瓦 · 60%
• 磁力搅拌器——JOANLAB0–1500转/分
• 恒温水浴锅0–100°C
• 涡旋振荡器—
• 带盖玻璃瓶250 · 500毫升
• 可灭菌离心管7毫升
• 量筒100 · 1000毫升
• 移液器100微升 · 1000微升 · 5毫升
• 烧杯2000毫升
• 培养皿Φ90毫米
• 玻璃涂布棒—

培养基与稀释液

稀释液

氯化钠18克，吐温80 2毫升，纯化水2000毫升。加热至完全溶解，分装于五个500毫升锥形瓶中，121°C灭菌30分钟。

NA培养基

蛋白胨10.0克，牛肉膏3.0克，氯化钠5.0克，琼脂粉15.0克，纯化水1000毫升。将各成分溶于水中混匀，用稀氢氧化钠溶液调至pH 7.0–7.2，加热溶解后用水定容至1000毫升。分装于三个500毫升锥形瓶中，121°C高压灭菌30分钟。

平板制备

在超净工作台内，将灭菌后的NA培养基倒入培养皿，每皿约15毫升。待平板平放凝固后备用。

预处理与活化

5.1液体样品

准确称取10.0克样品，置于装有90.0克稀释液的带盖玻璃瓶中，剧烈振荡1分钟。对于发酵液等液体产品，可置于常规超声波清洗仪（45瓦）中超声处理15分钟。

5.2固体样品

称取规定量样品（见附表1）于250毫升带盖玻璃瓶中，加入100克稀释液。浸泡20分钟后，用磁力搅拌器以1000转/分搅拌30分钟。用超声波细胞破碎仪对悬浮液进行超声处理：将探头插入液面下1.5–2毫米处，功率设为60%，超声4分钟，冰浴1分钟，再超声4分钟，冰浴1分钟。处理完毕后，保持悬浮液以1000转/分持续搅拌，备用。

样品稀释

取n支试管，转移经处理的悬浮液，进行十倍系列稀释至第n–1管；混匀。将第n–1管置于80°C水浴中——固体样品10分钟，液体样品20分钟。水浴结束后，立即用冷水将样品冷却至室温，再进行一次十倍稀释至第n管；混匀备用。此处n为试管数（见附表1）。

涂布与培养

选取4个无污染、无水珠的NA平板，分别标注编号、日期及稀释度。将第6节制备的第n管稀释液取0.1毫升移入每个NA平板，用无菌涂布棒从中心向外呈放射状均匀涂布。将平板平放于台面20–30分钟，使液体充分渗入培养基，随后倒置，于37±2°C培养18–24小时，观察并计数平板上的菌落。

计数

培养结束后，计数平板上的芽孢杆菌菌落。菌落数小于30或大于300的平板不计入统计。

8.1液体样品

液体样品中芽孢杆菌活菌孢子数N（CFU/毫升）按公式(1)计算：

8.2固体样品

固体样品中芽孢杆菌活菌孢子数N（CFU/克）按公式(2)计算：

污染率测定

9.1原理

采用NA培养基检测细菌污染，PSA培养基检测真菌污染。根据菌落形态及显微镜检，可区分典型芽孢杆菌菌落；随后对杂菌菌落进行计数。杂菌数占总菌落数的百分比即为样品的污染率。

9.2仪器与设备

同本方法第3节。

9.3试剂与溶液

PSA培养基。称取去皮马铃薯200克，切成小块，加自来水1000毫升煮沸30分钟，用四层纱布过滤取汁。加入蔗糖20.0克、琼脂15.0克，加热溶解后用水定容至1000毫升。分装于三个500毫升锥形瓶中，118°C灭菌30分钟，加入氯霉素至0.1‰，混匀后倒平板备用。NA培养基、稀释液及平板制备方法同第4节。

9.4操作步骤

9.4.1样品预处理——同第5节。

9.4.2样品稀释——同第6节。

9.4.3测定——选取2个无污染、无水珠的NA平板和2个PSA平板，分别标注编号、日期及稀释度。将9.4.2节第n–2管悬浮液进行十倍系列稀释，混匀后取0.1毫升分别加入PSA和NA平板，用无菌涂布棒均匀涂布。平放20–30分钟使液体渗入培养基后倒置，于30±2°C培养——NA平板培养2天，PSA平板培养5天——然后计数。

9.5计算

9.5.1液体样品杂菌数X（CFU/毫升）按公式(3)计算：

9.5.2固体样品杂菌数X（CFU/克）按公式(4)计算：

9.5.3污染率Y按公式(5)计算：

相关文件

• 适用的芽孢杆菌相关标准文件。
• 培养基及稀释液配制记录。
• 孢子计数原始数据记录。

修订记录

本文件于2026年5月修订。

附表1